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I Nitrati NO3− sono ioni presenti in natura formati dall’ossidazione dell’azoto e sono parte integrante del ciclo dell’azoto nell’ambiente. Oltre alla presenza naturale in frutta e verdura, i Nitrati sono anche usati come additivi alimentari per aromatizzare e conservare carne e prodotti a base di carne. Sebbene l’inclusione di nitrati abbia effetti benefici in termini di miglioramento della consistenza, del colore, del sapore e della durata di conservazione dei prodotti a
NO3−
base di carne e pollame, questa procedura è un’arma a doppio taglio poiché i nitrati negli alimenti sono stati implicati nella tossicità umana e nella cancerogenicità a causa della loro conversione enzimatica in nitriti NO2− nel corpo.
Nel suolo, i nitrati sono formati dall’azione di batteri nitrificanti, come i Nitrosomonas che ossidano gli ioni ammonio in nitriti, e che vengono ulteriormente ossidati a nitrati da batteri come Nitrobacter e Nitrococcus spp. Questi nitrati vengono assorbiti dalle piante attraverso le radici e, pertanto, diventano costituenti naturali delle piante. Una stima dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) afferma che il consumo umano medio giornaliero di nitrati varia dai 43 ai 141 mg, e di questo, le verdure ne apportano circa l’80%. I nitrati possono essere accumulati in quantità elevate dai tessuti vegetali e le verdure, come barbabietole e ravanelli, e le verdure a foglia, come sedano, spinaci e lattuga hanno dimostrato di accumulare più di 2500 mg di nitrati per 100 g, che è considerato un valore molto alto. L’accumulo di nitrati da parte delle piante può essere influenzato da diversi fattori biologici (come la cultivar e la varietà vegetale), fattori ambientali (come l’intensità della luce, la temperatura del suolo, le precipitazioni, ecc.) e metodi di lavorazione (come la temperatura di conservazione). Anche se, la ragione principale per un maggiore accumulo di nitrati da parte delle piante è da riportare al drastico aumento dell’uso di fertilizzanti azotati per migliorare la produttività delle colture. L’uso eccessivo di fertilizzanti azotati può anche causare un aumento della concentrazione di nitrati nell’acqua potabile a causa della lisciviazione nelle acque sotterranee.
Il primo uso di nitrati per la conservazione degli alimenti è stato registrato nell’antica India e Cina, come Ca(NO3)2 per la stagionatura della carne, conferendo un caratteristico colore e sapore rosso. Fu solo alla fine del 19 ° secolo che gli scienziati furono in grado di spiegare il meccanismo della colorazione della carne con il trattamento con nitrati. È stato stimato che le carni lavorate rappresentano meno del 5% del consumo totale di nitrati. I salumi hanno un caratteristico colore da rossastro a rosa che viene attribuito all’azione dei nitrati.
In primo luogo, i nitrati sono ridotti a nitriti dall’enzima nitrato reduttasi. I nitriti vengono quindi convertiti in composti come l’acido nitroso (HNO2) e l’ossido nitrico (NO), che è un prerequisito per la polimerizzazione. Successivamente, l’NO si lega allo ione Fe2+ presente nell’anello porfirinico della proteina globulare mioglobina, formando così un composto instabile, la nitrosomioglobina. Questo intermedio, in presenza di alte temperature o pH acido dà un pigmento rosso stabile chiamato nitroso-miocromogeno (l’anello nitrosoporfirina), formato dalla denaturazione della componente proteica della nitrosomioglobina. Inoltre, i nitrati vengono aggiunti anche per l’attività contro i batteri e gli agenti patogeni del deterioramento degli alimenti. I nitrati da soli non hanno alcun effetto antimicrobico diretto, ma funzionano come precursori dei nitriti, che sono attivi contro i patogeni come il Clostridium botulinum (prevenendo così il botulismo) e Staphylococcus aureus. A causa degli effetti tossici delle concentrazioni residue di nitriti nelle carni lavorate, l’uso di nitrati è stato gradualmente ridotto e attualmente il nitrato di sodio (E 251) e il nitrato di potassio (E 252), sono più comunemente utilizzati nella stagionatura della carne e nella conservazione di pesce e pollame.
Per oltre un secolo, sono state sollevate diverse preoccupazioni sul potenziale di nitrati e nitriti di formare agenti cancerogeni, portando a norme severe per il loro uso come additivi alimentari. Tuttavia studi recenti hanno suggerito che l’integrazione alimentare di nitrati può effettivamente avere un effetto protettivo rispetto alla salute cardiovascolare, tuttavia si è ancora lontani dal comprendere completamente il meccanismo di questo effetto.
Mentre i nitrati non hanno un effetto diretto sulla salute; è la loro conversione in nitriti in alcune condizioni fisiologiche nel corpo che è stata collegata alla tossicità e alla cancerogenesi nell’uomo. Sembra che il 5-7% dei nitrati ingeriti dall’uomo attraverso il cibo, venga convertito in nitriti dai batteri riduttori di nitrati presenti nella saliva nella cavità orale. Il metabolismo del nitrato a nitrito nel sistema digestivo in quantità elevate (che va da 0,4 a >200 mg/kg-¹ di peso corporeo) può causare metaemoglobinemia, o la sindrome del bambino blu. In questo disturbo, il nitrito formato ossida il Fe2+ presente nell’emoglobina, a Fe3+ convertendo così l’emoglobina in metaemoglobina e, di conseguenza, riduce la capacità di trasporto dell’ossigeno nel sangue. L’effetto cancerogeno indiretto dei nitrati è stato attribuito alla conversione dei nitriti in acido nitroso e ossidi di azoto (in condizioni acide come lo stomaco), che possono reagire ulteriormente con le ammine secondarie per formare nitrosammine secondarie. Le nitrosammine, in presenza di alta temperatura o basso pH, vengono convertite in ioni di-azonio che possono reagire con il DNA e causare mutazioni genetiche e, infine, il cancro. Oltre a questo, un’alta concentrazione di nitrati nell’acqua potabile è stata implicata nell’ingrossamento della ghiandola tiroidea, così come la prevalenza del diabete mellito di tipo 1 nei bambini di età compresa tra 1 e 18 anni. Gli studi hanno anche collegato alti livelli di nitrati alimentari all’aumento del numero di decessi per malattia di Parkinson e Alzheimer. Sebbene l’esposizione a nitrati e nitriti sia stata collegata all’aumentata incidenza di tumori gastrointestinali, nasofaringei e cerebrali, un rapporto contrastante dell’EPA (Environmental Protection Agency) statunitense ha sollevato seri dubbi sull’associazione di questi composti con lo sviluppo di tumori nei bambini e negli adulti.
Mentre diversi studi hanno proposto il legame tra nitrati alimentari e i loro successivi metaboliti ed effetti avversi negli esseri umani, c’è anche una ricerca emergente sui loro benefici per la salute. Diversi studi clinici sono stati condotti per valutare l’effetto positivo dei nitrati alimentari sulla salute cardiovascolare. I metaboliti dei nitrati, come i nitrosotioli e i nitroalcheni hanno dimostrato di avere effetti crioprotettivi, ipotensivi, e antipiastrinici. Il piano DASH (Dietary Approach to Stop Hypertension) si basa sull’ipotesi che l’aumento del consumo di verdure “ricche di nitrati”, come le barbabietole, gli spinaci ecc. è efficace per la gestione non farmacologica della pressione alta, perchè promuove la vasodilatazione. È noto che i S-nitrotioli formati dalla nitrosazione dei gruppi tiolici fanno parte delle vie di segnalazione coinvolte nelle funzioni fisiologiche, tra cui la vasodilatazione e la regolazione della pressione sanguigna. Sono state riportate riduzioni della pressione sanguigna dopo il consumo di succo di barbabietola attribuibile al carico di nitrati nella barbabietola. Ci sono anche riferimenti sull’integrazione dietetica di verdure ricche di nitrati e una minore domanda di ossigeno durante il lavoro submassimale, oltre ad una produzione di energia più efficiente. Risultati simili sono stati ottenuti anche dall’integrazione di nitrato sotto forma di succo di barbabietola. Tuttavia, finora, l’esatto meccanismo di queste ipotesi non è ancora stato chiarito.
L’OMS ha fissato i limiti consentiti per i nitrati alimentari a 300 mg/kg-¹ di peso corporeo per gli adulti e 25 mg per i bambini. Diversi studi hanno indicato gli effetti nocivi dei nitrati a dosi elevate, quindi è essenziale identificare e rilevare la concentrazione di questi composti negli alimenti. I nitrati possono essere rilevati direttamente o indirettamente mediante la riduzione a nitrito. Sono state descritte diverse tecniche per l’analisi dei nitrati negli alimenti; ne vediamo solo alcune:
L’International Organization for Standardization ha definito il metodo ufficiale per la rilevazione dei nitrati nel 1975 (ISO 3091:1975), in base al quale i nitrati sono stimati indirettamente dopo la riduzione a nitriti da cadmio metallico. La quantificazione dei nitriti viene effettuata spettrofotometricamente dalla reazione di Griess-Romijn, che si basa sulla conversione di ammine aromatiche come la sulfanilammide in ioni diazonio da parte dei nitriti. Questi ioni reagiscono quindi con una molecola di accoppiamento (per esempio, N-(1-naftil) etilendiammina) per formare un composto rosso, che viene rilevato a 540 nm. E’ stato sviluppato anche un metodo che utilizza l’ossidazione di un complesso blu di fosfomemolibdeno da parte del nitrito, causando una diminuzione dell’intensità del colore blu che viene letto a 814 nm. La concentrazione di nitriti è proporzionale alla diminuzione dell’assorbanza del complesso blu fosfomolibdeno. Per tenere conto del nitrito presente nel campione prima della riduzione del nitrato a nitrito, si usa polvere di zinco per ridurre il nitrato a nitrito e la concentrazione di nitriti è stata determinata sia prima che dopo la riduzione dal Griess-Romijn e la concentrazione di nitrati è stata calcolata come differenza tra la concentrazione di nitriti prima e dopo la riduzione. Gli studi hanno anche confermato l’uso del vanadio (III) e dell’enzima nitrato reduttasi per la riduzione del nitrato a nitrito.
La cromatografia ionica e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) sono le tecniche preferite per la rilevazione dei nitrati. La tecnica di pretrattamento più comune converte il nitrato in ioni NO2−, seguito dalla nitrazione di 2,4-dimetilfenolo. La specie indicatore è l’1,3,5-trimetossibenzene. Le tecniche cromatografiche possono essere accoppiate a diversi sistemi di rivelazione quali UV, elettrochimici, fluorimetrici, cattura elettronica e spettroscopia di massa per l’analisi dell’eluente.
Rilevazione elettrochimica La rilevazione elettrochimica dei nitrati può essere voltammetrica o potenziometrica. I nitrati sono ridotti a nitriti da una colonna Cu/Cd o dalla nitrazione di composti aromatici, come l’acido benzoico o l’acido salicilico. La derivata ottenuta viene determinata ad un elettrodo di carbonio vetroso mediante analisi voltammetrica. Per l’analisi potenziometrica, gli elettrodi ionoselettivi commerciali (ISE), vengono utilizzati per trasferire particelle cariche da una fase all’altra, il che crea una differenza di potenziale misurabile. La sensibilità può essere migliorata utilizzando una membrana selettiva per i nitrati. L’elettroforesi capillare è un metodo rapido di rilevamento degli anioni e richiede volumi più piccoli sia del tampone che del campione per l’analisi. Un capillare rivestito di polietilenimmina viene utilizzato per la separazione degli anioni e il rilevamento dei nitrati viene effettuato mediante rilevamento UV a 214 nm. Biosensori
I biosensori sono costituiti da un biorecettore, un trasduttore e un rilevatore. Il segnale del rivelatore generato dal legame dell’analita al biorecettore genera un segnale, che viene convertito dal rivelatore in un segnale misurabile come tensione o corrente. I biosensori stanno rapidamente guadagnando attenzione grazie alle loro dimensioni compatte che possono ridurre il costo complessivo dell’uso dei biosensori. La nitrato reduttasi viene utilizzata nella sintesi di biosensori in quanto può convertire il nitrato in nitrito. E’ stata studiata l’efficacia di un nanotubo di carbonio/ polipirrolo/elettrodi di biofilm reduttasi per il rilevamento di nitrati con risultati promettenti.
A causa degli effetti dannosi proposti dei nitrati sulla salute, sono in corso studi per cercare alternative a questi nitrati. Una strada sarebbe quella di eliminare i nitrati nella lavorazione della carne mediante “stagionatura naturale”, cioè utilizzando fonti vegetali ad alto contenuto di nitrati come la polvere di sedano con batteri che riducono i nitrati. L’aggiunta di sostanze chimiche come esteri fumarati, idrossianisolo butilato, anidride solforosa ecc. potrebbe essere efficace, tuttavia, gli effetti a lungo termine di tali sostanze chimiche non possono essere previsti. Un’altra tecnica potrebbe essere l’aggiunta di prodotti come l’ascorbato e gli acidi ascorbico, che possono prevenire la formazione di nitrosammine dai nitriti, eliminando così il potenziale cancerogeno dei nitrati. Un’ampia letteratura descrive il potenziale di diverse spezie come alternative ai nitrati grazie alle loro proprietà antiossidanti e antibatteriche.
Nonostante tutti gli anni di ricerca, c’è ancora ambiguità per quanto riguarda sia gli effetti positivi che negativi dei nitrati. Pertanto, dovrebbero essere condotti ampi studi clinici per comprendere la farmacocinetica e il metabolismo dei nitrati nell’uomo.Poiché gran parte dei nitrati alimentari proviene da verdure, lo sviluppo di nuove cultivar che hanno ridotto l’accumulo di nitrati e una maggiore tolleranza allo stress potrebbe essere un’opzione interessante. Inoltre, pratiche agricole più ecocompatibili come la rotazione delle colture, la gestione del bestiame, ecc., possono ridurre efficacemente la quantità di fertilizzanti azotati, senza peraltro influenzare drasticamente la produttività. Diversi studi hanno dimostrato che le verdure biologiche hanno un contenuto di nitrati inferiore rispetto a quelle coltivate convenzionalmente, e quindi alcuni scienziati suggeriscono che il consumo di verdure biologiche potrebbe ridurre l’esposizione alimentare ai nitrati. L’utilizzo di pratiche culinarie come la cottura ad alte temperature potrebbero ridurre i prodotti tossici di nitrosazione del metabolismo dei nitrati. Per quanto riguarda L’uso dei nitrati nella conservazione degli alimenti, ulteriori studi di tecnologie alternative come radiazioni UV, radiazioni ionizzanti, processi ad alta pressione ecc., sono allo studio per migliorare la loro efficacia, anche in termini di costo.